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超氧化物歧化酶(SOD)基因並在大腸桿菌裏誘導
摘 要:從人橫紋肌肉瘤(RD)細胞株中提取總RNA,經RT-PCR擴增出SOD基因片段,經限制性內切酶 (BamH,Sma)酶切後按正確的讀碼框順序插入到pGEX-4T-2表達載體上,重組質粒轉化大腸桿菌,經菌落PCR和質粒雙酶切鑒定、序列測定確認,證實成功地構建了人SOD基因融合表達載體. 將該基因插入含1_7啟動子的質粒pET一32a 中構建表達質粒pET—sod,然後將該表達質粒轉入大腸桿菌BI21中進行蛋白表達,表達菌株用lmmol/L IPTG誘導表達數小時後,產生較多重組的蛋白,且該蛋白以可溶性蛋白形式存在.SDS—PAGE分析表明:在相對分子量約為22kd的位置有一條明顯蛋白質帶.將誘導表達後的蛋白通過親和層析的方法進行.
關鍵詞:超氧化物歧化酶;基因重組;表達;純化
細胞在生命過程中經新陳代謝產生多種自由基,如超氧陰離子自由基(O- )、羟基自由基(OH )、脂自由基(ROO )、二氧化氮和一氧化氮自由基,加上過氧化氫、單線態氧和臭氧,通稱活性氧(ROS).體內活性氧自由基參與免疫和信號傳導過程.但過多的活性氧自由基有破壞行為,導致人體正常細胞和組織的損壞,從而引起多種疾病,如心臟病、老年癡呆癥、帕金森病和腫瘤等.生存在富氧環境中的需氧生物進化出了可清除過量氧自由基的防禦體系,其中的超氧化物歧化酶是清除氧自由基特別是超氧陰離子的第一道也是最重要的一道防線[1].超氧化物歧化酶於1969年由McCord和Fridovich從牛血紅細胞中發現並提取,確定其具有酶活性,命名為SuperoxideDismutase,簡稱SOD[2].SOD廣泛分布於生物體內,是一類金屬酶,在抗氧化防禦中發揮重要的作用.根據輔基結合的金屬離子的不同,SOD可分為3類:CuZn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD.CuZn-SOD存在於真核細胞細胞漿和某些原核細胞中,Mn-SOD存在於原核細胞和真核細胞線粒體中,FeSOD存在於原核細胞和一些高等植物細胞中[3].在人體中,超氧化物歧化酶也含有三類:SOD1定位於細胞質中;SOD2位於線粒體;SOD3則位於細胞外.SOD1和SOD3的活性位點含有銅和鋅,而SOD2則含有錳.它們的基因分別定位於21號、6號和4號染色體[3].
SOD的主要功能是催化超氧陰離子自由基(O- 歧化為O 和HO(2O-+2H+ O+HO),具有重要的生理學作用.
1.1 材料
TripureIsolationReagent購自Roche公司,M-MLVRTasecDNASynthesisKit為TaKaRa公司產品, 質粒DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Omega公司,GlutathioneSepharose4B購自GE公司,異丙基--D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)購自Sigma公司,表達質粒pGEX-4T-2和大腸桿菌DH5 菌株由本實驗室保存, TaqDNA聚合酶、dNTP、Sma 酶、BamH 酶、T4DNA連接酶、蛋白質標準marker購自Ferments,DNAmarker購自上海生工,其他試劑均為國產分析純.
1.1.1 引物合成及PCR擴增
上遊弓J物(5 ~3 )…ATTGAATTCATGGCGACGAAGGCC…
BamHI
下遊弓l物(5 ~3 )…ATTGGATCCTTATTGGGCGATTCC…
SalI
反應體系為50ul,PCR反應條件:94 ̄C預變性5 min,一個循環;94 ̄C變性1 min,56 ̄C退火1 min,72℃延伸1.5 min,35個循環.
1.2 方法
1.2.1 人橫紋肌肉瘤(RD)細胞株RNA的提取 取1個6cm培養皿人人橫紋肌肉瘤(RD)細胞株細胞,用移液器吸去培養基,加入1mL的Tripure,吹打幾次後轉入1.5mL的Eppendorf管中.加入200 L氯仿,劇烈振蕩混勻30s,4 下12000r/min離心10min.將上清液轉移到RNase-free離心管裏,加入等體積的異丙醇,室溫下放置5min,4 下12000r/min離心12min,小心移去上清液,防止RNA丟失,用70%酒精洗滌兩次,每次700 L,12000r/min離心2min,小心吸去上清液.沈澱在室溫下放置3~5min,使酒精完全揮發,然後用30~50 L的DEPC-H2O溶解.
1.2.2 總RNA的逆轉錄 將4 g總RNA與Oligo(dT)18Primer(1 g/ L) 1 L放入RNase-free的Eppendolf管中,75 變性5min,立即冰浴,隨後加入:5 逆轉錄酶緩沖液4 L,10mM的4種dNTPs混合液2 L,M-MLVReverseTranscriptase1 L,RNaseInhibitor(20U/ L) 2 L.加水補足至20 L,25 反應10min,42 反應30min後,70 加熱15min終止反應.
1.2.3 SOD基因的重組表達 在20 LPCR反應體系中加入:10 TaqBuffer(含Mg2+) 2 L,dNTPs1 L,基因特異性引物1為10nmol,基因特異性引物2為10nmol,Taq酶0.5U,cDNA模板1 L,補水至20 L.實驗同時設置陰性對照,在PCR擴增儀中進行反應,反應條件為:94 預變性3min,94 變性1min,58 退火30s,72 延伸30s,進行38個循環後72 延伸10min.PCR產物經常規方法電泳、切膠回收、雙酶切(SmaI,BamHI)、連接、轉化、菌落PCR初篩重組子,雙酶切鑒定後挑選陽性克隆送上海生工測序部測序.
測序驗證插入片段的序列正確後,挑取含有重組質粒的單菌落於5mLLB液體培養基(含氨苄青黴素100 g/mL),37 搖培過夜.按1 100的比例吸取菌液於新的5mL LB液體培養基(含氨苄青黴素100g/mL),37 搖培至OD600為0.6左右時加入異丙基--D-硫代半苷(IPTG)至終濃度0.25mmol/L,37 繼續搖培4~6h.誘導表達的菌液於5000r/min離心5min收集菌體,加入冰冷的1mL1 PBS緩沖液,冰浴條件下超聲裂解細菌(150W 1 s 50次),間隔2 s. 4 下10000 g離心10min後上清與沈澱分別與SDS-PAGEloadingbuffer混合,SDS-PAGE電泳確定重組蛋白是否表達以及表達的蛋白質是否形成包涵體.1.2.4 SOD重組蛋白的純化 按1 100的比例吸取菌液於新的250mLLB液體培養基(含氨苄青黴素100g/mL),37 搖培至OD600為0.6左右時加入異丙基--D-硫代半苷(IPTG)至終濃度0.25mmol/L,37 繼續搖培4~6h.誘導表達的菌液於5000r/min離心5min收集菌體,加入冰冷的15mL1 PBS緩沖液,冰浴條件下超聲裂解細菌(150W 10s 10次),間隔10s. 4 下10000 g離心20min後上清與預先用1 PBS緩沖液平衡的GlutathioneSepharose4B混勻,4 輕搖30min,裝柱.用5~10個柱床體積的洗滌緩沖液(1PBS)洗去雜蛋白,至流出液的OD280接近於零後用洗脫緩沖液(50mmol/LTris-HCl,10mmol/L還原型谷胱甘肽,pH為8.0)洗脫目的蛋白.SDS-PAGE鑒定純化的融合蛋白.
1.2.2人橫紋肌肉瘤(RD)細胞株超氧化物歧化酶基因在大腸桿菌中表達質粒的構建和轉化
將人橫紋肌肉瘤(RD)細胞株超氧化物歧化酶基因片段用BamHI,SalI雙酶切,回收片段,與預先經雙BamHI,SalI雙酶切的pET一32a ’回收片段相連接,構建大腸桿菌表達質粒pET—sod.將此表達質粒轉人大腸桿菌BL21中.經含有Amp(100ug/L)抗性的培養基篩選表達質粒.
1.2.3人橫紋肌肉瘤(RD)細胞株超氧化物歧化酶基因在大腸桿菌中的表達及純化
挑取單克隆在LB培養基含Amp(100ug/L)中,37 ̄C下培養至OD600=0.4~0.6,加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導6h後收集菌液,將收集的菌用Tris—C1(pH 7.4)洗3~4次,超聲破碎.將破碎後的菌以12000 r/min離心10 min,分別取破碎後的全菌、上清和沈澱SDS—PAGE分析.蛋白純化按照No—vagen公司的Ni—NTA His.Bind
Resins的操作說明書進行:將蛋白過事先準備好的Ni Agrose柱,靜置30~40 min,後用20 mmoL/L咪唑洗脫雜蛋白,用250 mmoL/L的咪唑緩沖液洗脫結合蛋白.
1.2.4 酶活性測定和蛋白含量測定
酶活性測定用NBT光還原法 .
SOD活性=2(OD56o對照一OD56o處理)×稀釋倍數/OD56o空白.
酶比活力(U/mg)=SOD酶液活性(U/Hd)/酶液蛋白含量(mg/m1).
蛋白質含量的測定;h-N:將純化後的蛋白稀釋一定倍數後至300 試管內,再加入考馬斯亮藍G一2502.7Ⅱ1L混勻,室溫下靜置2 min,鋇0其595 nln下的吸光度,根據牛血清蛋白標準曲線計算其蛋白含量.
2 結果與分析 1 2 32.1人橫紋肌肉瘤(RD)細胞株超氧化物歧化酶基因的克隆
將以人橫紋肌肉瘤(RD)細胞株總DNA為模板進行PCR擴增的產物經10 L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,可得到一條長與預期大小相符的DNA擴增片段(圖1).將PCR產物雙酶切回收後由T4連接酶與pUC一19相連後進行序列測定.測序結果如圖2,GenBank登錄號為NM_000454
.
2.2人橫紋肌肉瘤(RD)細胞株超氧化物歧化酶在大腸桿菌中表達載體的鑒定 750b
克隆在pUC一19的基因片段用B啪HT及SalI雙酶切,回收片段, 並與事先經BamHI及SalI雙酶切的pET一32a ’相連接,構建表達質粒pET—sod,酶切鑒定結果如圖3. 2.Negative control;
2.3人橫紋肌肉瘤(RD)細胞株超氧化物歧化酶基因在大腸桿菌中的表達 ・Amp ied PCR product・SDS—PAGE分析表明,在相對分子量約為22 kDa的位置上有一 圖 0D基因的PcR擴增條明顯的表達條帶(圖4),表明蛋白以可溶性蛋白存在上清中.
2.4 表達產物的純化和活性測定
經IPTG誘導表達的大腸桿菌菌體,冰浴下經超聲破碎、Ni。 親和純化後,利用NBT光還原法測定
3 討 論
超氧化物歧化酶(SOD)是生物有機體清除超氧陰離子自由基的一個重要的保護酶.目前已經對許多生物的SOD及其基因進行了廣泛的研究,
2 結果與分析
2.1 人超氧化物歧化酶(SOD) 基因的PCR擴增結果
人超氧化物歧化酶基因(SOD)的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳後,結果見圖1.圖中M為DNAMarker;1為陰性對照;2為人SOD基因PCR產物.在約500bp處可清楚地觀察到一DNA條帶,與預期一致.2.2 重組大腸桿菌菌落的PCR擴增結果
重組質粒所培養的大腸桿菌菌落PCR擴增經1.2%瓊脂糖凝膠電泳後結果見圖2.圖中M為DNAMark;1為陰性對照;2~6為菌落PCR產物.在約500bp處可在2~6孔中清晰看到所挑取菌落的菌落PCR的DNA條帶,但並不排除假陽性的可能性,仍需重組質粒雙酶切鑒定.
2.3 重組質粒雙酶切鑒定結果
挑取菌落PCR陽性菌落培養,提取質粒後,經BamH 和SmaI聯合酶切,酶切結果見圖3.圖中M為DNAMarker;1為未酶切重組質粒;2為重組質粒雙酶切;3為PCR產物.結果表明,重組表達載體經雙酶切後產生大小約為4900bp和500bp的2條DNA條帶,與預期結果一致.陽性菌落送上海生工測序.2.4 重組菌經IPTG誘導表達誘導重組菌4h後超聲破碎,SDS-PAGE結果見圖4.圖中M為蛋白質Maker;1為非重組菌未經IPTG誘導;2為非重組菌經IPTG誘導;3為重組菌未誘導;4為重組菌37 誘導4h;5為重組菌37 誘導4h超聲破碎後上清;6為重組菌37 誘導4h超聲破碎後沈澱.SDS-PAGE結果表明,4、5、6泳道在約45kD處出現一條非常明顯的誘導蛋白條帶,且其分子量與預期大小一致,而對照組(未經IPTG誘導的重組菌株)中看不到此帶.說明SOD基因插入表達載體pGEX-4T-2後在大腸桿菌中獲得了高效表達,且可獲得分泌型表達,利於進一步純化.
2.5 重組蛋白純化
純化的重組蛋白經SDS-PAGE分析,結果見圖5.圖中M為蛋白質Maker;1為非重組菌未經IPTG誘導;2為非重組菌經IPTG誘導;3為重組菌未誘導;4為重組菌37 誘導4h;5為純化的SOD由圖估計,經GlutathioneSepharose純化後獲得了高純度的重組融合蛋白,重組蛋白的純度達到了90%以上.
討論
近年來的許多研究表明氧自由基對細胞具有許多毒副作用,特別是引起細胞DNA損傷,造成基因突變、缺失、重排與加倍,從而導致細胞程序性死亡、某些原癌基因的活化及抑癌基因的失活[10].超氧化物歧化酶SOD作為一類重要的抗氧化酶類,其臨床應用特別是在疾病相關的基因治療上的醫用價值越來越受到人們的關註.有資料表明SOD基因轉錄活性的降低可能是導致SOD活性降低的重要原因,表明SOD在衰老過程中扮演著重要角色,具有維持線粒體的功能和發揮抗衰老的作用.同時,超氧化物歧化酶對炎癥、缺血再灌註損傷、輻射損傷均有一定療效,還可減少抗癌藥物對細胞和心臟的毒副作用.賀華君等的研究提出,將人CuZn-SOD靶向到中樞神經系統能夠為氧自由基相關的神經性疾病,如癫痫、創傷以及與腦退化相關的帕金森病、亨廷頓舞蹈病和肌萎縮性側硬化(ALS)等提供新的治療途徑.
在食品工業中,SOD可作為食品抗氧化劑,防止過氧化酶引起的食品變質及腐爛現象,或作為食品營養的強化劑,有延緩衰老的作用;在化工行業中,SOD可作為化妝品的添加劑,有抗皺、祛斑、防曬及抗炎等功效;在保健品行業,SOD還可制成藥丸或藥片劑型的營養補充品.
由於超氧化物歧化酶的醫療和臨床應用前景,因此開展人SOD基因工程及其下遊技術的研究有重要意義.本實驗運用分子生物學技術從人橫紋肌肉瘤(RD)細胞株細胞的cDNA中擴增出人超氧化物歧化酶(SOD)的基因,經限制性內切酶雙酶切後插入到表達質粒pGEX-4T-2上構建融合表達載體,重組質粒轉化感受態大腸桿菌DH5 ,經菌落PCR、質粒雙酶切及測序表明其拼接正確.IPTG誘導後進行SDS-PAGE電泳,表明SOD基因在重組質粒上成功表達,並純化出了目的蛋白.實驗結果證明已成功構建了含pGEX-4T-2-SOD表達質粒的大腸桿菌表達菌株,且表達的融合蛋白帶有GST標簽,利於後期的純化、制備多克隆抗體及ELISA免疫分析.
參考文獻:
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